Реакция преципитации не используется. Реакция преципитации. Области применения

Этот метод применяется для изучения антигенного состава и серологического сродства фитопатогенных бактерий. Агар, используемый для реакции преципитации в агаре, готовят следующим образом: сначала его промывают в течение 21 дня слегка подщелоченной водой, а затем дистиллированной и высушивают. После этого готовят 1%-ный агар на физиологическом растворе, который в горячем состоянии трижды фильтруют через бумажный фильтр. В качестве консерванта добавляют мертиолат (1: 10000 – 100 мг на 1 л агара) или 5%-ный спиртовой раствор тимола (на 1 л агара 10 мл). Готовый агар разливают в колбочки по 25–50 мл или 100 мл и хранят на холоду или при комнатной температуре. Можно для этой цели использовать также агар фирмы ДИФКО, который не требует отмывания.

Постановка реакции. Агар разливают в чашки Петри по 25 мл. После остывания в агаре при помощи пробирки диаметром 1 см пробивают лунки: одну в центре и на одинаковом от нее расстоянии (1–1,5 см) еще четыре, пять или шесть лунок. В каждую лунку пастеровской пипеткой вносят две-три капли расплавленного агара для формирования дна. В центральную лунку обычно наливают иммунную неразведенную сыворотку, а в остальные лунки – рабочие разведения антигенов (чаще всего в разведении 1: 100). Рабочее разведение антигенов, дающее наибольшее число зон преципитации, устанавливают путем испытания различных разведений антигенов с гомологичными сыворотками.
Реакцию преципитации в геле можно ставить также на стеклах с бортиками в 2 мм. Для получения лунок используют специальные штампы, состоящие из узких трубок с заостренными краями, вмонтированными в диск из плексиглаза. Чашки и стекла с заполненными лунками помещают в эксикатор с водой и выдерживают в течение 21 дня при комнатной температуре. Первые три дня ежедневно в лунки добавляют сыворотку и антигены, убывающие в результате активной диффузии. В последующие дни реагенты добавляют через четыре-пять дней. Наблюдение и регистрацию появления линий преципитации проводят ежедневно. Фиксировать результаты на фотопленку следует не позже чем на десятый день, так как четкие линии преципитации со временем расслаиваются и создают ложное впечатление о большем количестве антигенов.
Слабые, плохо видимые линии преципитации можно усилить раствором сернокислого или хлористого кадмия в воде (концентрация кадмия сернокислого – 0,065%, хлористого – 0,056%). Чашки и стекла заливают раствором кадмия на 15 мин – 2 час. После указанной обработки линии четко видны, их фотографируют, помещая стекла на специальном станке в физиологическом растворе. Антигены, использованные для реакции преципитации, могут быть получены различными методами.
1. Метод Буавена. 24–48-часовую культуру, выращенную на мясопептонном или картофельном агаре и трижды промытую при центрифугировании физиологическим раствором, суспендируют в 10-кратном по весу количестве 1-4-н. трихлоруксусной кислоты. Взвесь охлаждают в течение 3 час, затем центрифугируют в течение 15 мин при 8–10000 об/мин. Полученный экстракт очищают диализом в коллодиевых или целлофановых мешочках в водопроводной воде в течение двух суток и затем в дистиллированной в течение суток. Для получения сухого антигена из диализированного раствора его осаждают спиртом (4–5 объемов). Осадок промывают спиртом, эфиром и высушивают в вакууме.
2. Метод Бернгофа. Взвесь бактерий обрабатывают 1/16 -н. NaOH, доводя реакцию жидкости до 7,4–7,6 (pH определяют при помощи 0,25%-ного спиртового раствора розоловой кислоты).
Затем жидкость нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют. Фильтрат и его разведения от 1: 10 до 1: 1000000 используют в качестве антигена при постановке реакции преципитации.
3. Раствор антигена готовят из взвеси бактерий, содержащей 10в14 клеток в 1 мл, который подвергают автоклавированию в течение 2 час при 1 атм.
4. Антигены из бактерий извлекают нагреванием при температуре 75° С в течение 30 мин.
5. Метод обработки раствором фенола по Штаппу. Густую взвесь бактерий заливают 0,5%-ным фенолом, ставят в холодильник на шесть недель и ежедневно встряхивают. Прозрачную жидкость отделяют (антиген) центрифугированием или фильтрованием.
6. Метод накопления в МПБ. Культуру бактерий засевают в пробирки с бульоном и ставят в термостат на три-четыре недели при 25° С. Затем бульон с развившимися бактериями фильтруют через фильтр Зейтца или центрифугируют. Полученный фильтрат или центрифугат, а также его разведения служат антигеном для постановки реакции преципитации.

Реакция преципитации (РП)

Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 1). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.

Рис. 1. Реакция преципитации:1 - антиген; 2 - антитело.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони. Для постановки реакции используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 2).

Рис. 2. Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации; Б - реакция преципитации по Оухтерлони.

Реакция кольцепреципитации

Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1- 0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 2). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител.

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка. Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 3). Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 3).

Рис. 3. Простая радиальная иммунодиффузия:а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая.

Реакция иммуноэлектрофореза (ИЭФ)

В основе реакции лежит принцип преципитации. ИЭФ, как правило, используется для исследования антигенной структуры микроорганизмов. Реакцию проводят в два этапа. Вначале проводят электрофоретическое разделение антигена в забуференном агаровом геле. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. Затем через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. После этого в канавку, которая расположена по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются дугообразные линии преципитации. С помощью ИЭФ анализируются состав и количество белков сыворотки крови, спиномозговой жидкости, микробных протеинов (рис. 4).

Рис. 4. Реакция иммуноэлектрофореза.

Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Механизм. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата -помутнение.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в"вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.

15. Реакция с участием комплемента: реакция гемолиза, реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, применение.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент

комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана)